一、什么是单细胞转录组？

继下一代测序技术(NGS)出现后,测量RNA的高通量方法迅速发展,通常被称为bulk RNA_seq技术,常用于研究control/diseased之间的转录组差异,推动了研究正常生物过程和疾病的方法发生革新性变化。然而,bulk RNA_seq方法存在一个主要局限性:只能估计每个基因在细胞群中的平均表达水平，无法考虑该样本中单个细胞基因表达的异质性，忽略了细胞间基因表达调控的差异性。随着2009年汤富酬老师首先开发单细胞转录组技术后，单细胞转录组技术如雨后春笋般涌现出来，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。单细胞转录组技术的出现使得我们可以把研究的精度从组织多细胞层面精确到单个细胞领域，可以单独研究某个细胞或者某群细胞具体的特征，进而发现新的或稀有的细胞类型，识别 control/diseased组织之间的差异细胞组成或了解发育过程中的细胞分化，不只如此，还在细胞发育、tumor微环境、单细胞图谱绘制方面发挥了关键作用。

单细胞转录组的平台有很多，常用的有10xGenomics、BD（华大），其中10xGenomics市场占有率更高，因此主要介绍基于10xGenomics单细胞转录组平台数据分析以及注意事项。

二、为什么要进行单细胞转录组研究？

1、传统的转录组研究通常基于混合的细胞群体，得到的是平均的基因表达水平，无法揭示细胞群体中的异质性。单细胞转录组技术可以对每个单独细胞进行分析，揭示不同细胞类型或亚群体之间的差异。

2. 在混合细胞群体中，某些稀有细胞类型的基因表达信号可能被掩盖。单细胞转录组技术能够识别和分析这些稀有细胞类型，提供更全方面的细胞群体信息。

3. 单细胞转录组技术可以揭示细胞在不同发育阶段或不同条件下的状态变化。例如，在研究细胞分化过程时，可以追踪每个细胞从祖细胞到成熟细胞的转变路径，揭示细胞分化的动态过程。

4. 单细胞转录组技术在cancer、免疫疾病等领域有广泛应用。它可以揭示tumor微环境中不同细胞类型的相互作用，识别疾病相关的细胞亚群，帮助理解疾病的发生和发展机制，从而推动精细医疗的发展。

5. 通过单细胞转录组技术，可以分析不同细胞类型对药物的反应，识别出对药物敏感或耐药的细胞亚群，帮助优化药物treatment方案。

三、如何实现单细胞转录组测序？

基于标签（barcode）的单细胞识别。中心思想是：在对每个细胞的mRNA测序前做逆转录时，为其加上单独的标签序列。这样即便是混合起来测序，也可以把携带相同标签序列（barcode）的RN**段视为来自同一个细胞。通过这种策略，可以通过一次建库，测得上万个单细胞的信息（如下图所示）。但是要实现单细胞转录组测序，需要解决以下2个难题

 1.PCR偏差：单个细胞含有约10pg total RNA，而约80%以上信息为rRNA，从单细胞RNA到文库意味着核酸的扩增量要达到百万倍以上。而在这个高的扩增量不引入PCR偏差一直是个较大的问题。可以想一下，如果两个样本基因表达量是相同的，但扩增效率A是99%，B是97%，在扩增30个循环后，两者在扩增后的表达就有了1.84倍的差异。而当我们分析差异基因的时候如果选1.5倍作为差异基因的标准，那么本来没有差异的基因也会出现差异。

 2.去除rRNA：rRNA（核糖体RNA）在total RNA占比一般在80%以上，如果不加区分地进行逆转录，再扩增、建库很可能测序得到的绝大部分序列是rRNA的序列，但是一般情况下，如果你更关心mRNA等编码基因的序列，rRNA序列不能给我们带来有效的信息，可以说它是无用的。

四、技术原理

(1)形成GEMs：基于微流控芯片形成油包水（GEMs），每个油包水内含有一个细胞、一个gel bead以及逆转录需要的引物试剂和酶等，单个GEM内可进行单独逆转录反应互不干扰。

(2)标记细胞和RNA分子 Gel bead上带有标签，GEMs进行逆转录，可将10× barcode（10× BC，用来标记细胞)、UMI（标记本底RNA进行定量）加在每个mRNA分子上。

实验流程：

五、数据分析

经过测序且对原始数据处理后得到的是一个稀疏表达矩阵，行为基因，列为细胞，其实就是每个细胞所有的基因表达情况。后续10xGenomics单细胞转录组的分析几乎都是基于上述方式得到的表达矩阵进行分析的，单细胞转录组研究的本质就是研究我们捕获细胞的的异质性，也就是研究细胞与细胞之间具体有什么差异，细胞与细胞之间有什么联系，故而单细胞分析的中心就是如何确定样本中细胞的类型。目前常用的分析R包是 Seurat，官网有着详细的代码示例。

1.单细胞转录组表达矩阵的获取

10xGenomics单细胞转录组表达矩阵一般是通过cellranger软件获取，cellranger为10xGenomics官方分析软件，有详细的文档说明。

2.质控与过滤

中心目的：去掉各种各样的低质量的细胞。

1. 什么是低质量的细胞？

• 一些即将死亡的细胞（明显表现在线粒体基因过高且基因数量较少） 

• 测序技术的原因，一个孔内包含了两个或多个细胞，这种情况下，我们测得的细胞的基因表达量将会异常地高。正常细胞的基因表达量通常在3000-4000左右。

2. 常见的处理：

• 删除高于一定阈值基因数的细胞，低于一定阈值基因数的细胞，以及线粒体基因比例高于一定阈值的细胞。

根据项目不同阈值有所不同，另外更好根据图形进行判断。https://www.nature.com/articles/s41467-023-42911-1 （可以查看该论文的详细处理过程)

3. 可视化

• 用小提琴图探索一下特征的分布情况

• 利用散点图，看一下不同变量间的相关性

• 定义过滤条件，将质量差、非单细胞的数据剔除掉，再用小提琴图查看一下特征的分布情况

3. 数据归一化、寻找高变基因与标准化

(1)为什么需要对数据进行处理？

由于实验和测序步骤都具有随机性，即便是同一细胞在两次捕获测序中得到的深度也不一定相同，因此直接比较原始表达计数得到的差异可能是由于技术偏差造成。 表达矩阵标准化通过对count数进行调整，使获得具有可比性的相对表达丰度。 数据处理的目的：

● 使细胞间表达具有可比性

● 使表达量分布符合统计学分布

(2)如何对数据进行处理？

a.数据标准化 most常用的方法是针对测序深度进行标准化，使每个细胞具有相同的reads数据量 Seurat默认的标准化方法为 LogNormalize ： 以e为底数，log（每个细胞中基因的nCount_RNA /该细胞内总Count*10000 + 1）

b.筛选高变基因 对于一个给定的单细胞数据集，其中有许多基因都不能提供有用信息，并且大多只包含零计数。即使在QC步骤中滤除了这些零计数基因后，单细胞数据集也可能超过15,000个基因； 为了减轻下游分析工具的计算负担、减少数据中的噪声并方便数据可视化，可对数据集基因进行过滤只保留对数据的变异性具有信息贡献的基因（变化程度大）； 高变基因：在表达矩阵中表达变化大的基因，即在一些细胞中高表达，在另外一些细胞中低表达； 一般使用均值与方差之间的关系来挑选高变基因： Seurat默认的标准化方法为vst：首先利用loess回归对log(variance)和log(mean)拟合一条直线，然后利用观测均值和期望方差对基因表达量进行标准化，final根据标准化后的表达量计算方差；

c.数据归一化 对表达矩阵进行scale处理，scale之后的矩阵每个基因表达均值为0 经过scale之后，所有基因的表达分布基本一致，有助于后续的降维聚类

4. 降维与初步聚类、查看是否有批次效应

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种高通量测序技术，它产生的数据集在细胞和基因数量上都具有很高的维度。这立即指向了一个事实，即单细胞RNA测序数据受到了"维度诅咒"的困扰，更高维度的数据往往包含更多的噪声和冗余，因此增加更多的信息并不利于后续的分析步骤。

• 常见的降维方式：PCA、t-SNE、UMAP

1. 具体流程

(1)首先对数据进行PCA降维单细胞

(2)其次进行t-SNE、UMAP

(3)观察t-SNE、UMAP的样本或分组分布是否相似判断是否有批次效应

(4)利用harmony对批次效应进行处理

5. 聚类与market注释

基于去除批次效应的数据重新聚类，并进行market注释

• market注释

通过聚类好的细胞簇，让某一细胞簇和其他细胞簇进行差异基因分析，进而通过差异基因注释

常用的注释网站CellMarker

6. 细胞比例的分布

一般多组多样本的情况下除了关注基因表达模式受不同条件所影响导致的改变，还会关注细胞组成（例如细胞类型的比例）在不同条件下发生变化。

7. 针对不同细胞类型进行差异分析富集分析等等

通过上面的注释对不同分组下感兴趣的细胞类型进行差异分析，与Bulk RNA相似，进而可以做富集分析、GSEA、GSVA。 注：以上是研究细胞与细胞之间具体有什么差异的标准流程，而细胞与细胞之间有什么联系则一般是高级分析的细胞通讯、拟时序分析。

六、单细胞转录组的应用

(1)图谱性研究：A pan-cancer single-cell tranional atlas of tumor infiltrating myeloid cells

(2)发育分化方向：Molecular architecture of the developing mouse brain

(3)细胞周期方向：An alternative cell cycle coordinates multiciliated cell differentiation

(4)treatment：Progenitor-like exhausted SPRY1+CD8+ T cells potentiate responsiveness to neoadjuvant PD-1blockade in esophageal squamous cell carcinoma

七、送样要求

参考文献

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3. Cheng S, Li Z, Gao R, Xing B, Gao Y, Yang Y, Qin S, Zhang L, Ouyang H, Du P, Jiang L, Zhang B, Yang Y,Wang X, Ren X, Bei JX, Hu X, Bu Z, Ji J, Zhang Z. A pan-cancer single-cell transcriptional atlas of tumor infiltrating myeloid cells. Cell. 2021 Feb 4;184(3):792-809.e23. doi: 10.1016/j.cell.2021.01.010. PMID: 33545035.

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6. Liu Z, Zhang Y, Ma N, Yang Y, Ma Y, Wang F, Wang Y, Wei J, Chen H, Tartarone A, Velotta JB, Dayyani F,Gabriel E, Wakefield CJ, Kidane B, Carbonelli C, Long L, Liu Z, Su J, Li Z. Progenitor-like exhausted SPRY1+CD8+ T cells potentiate responsiveness to neoadjuvant PD-1 blockade in esophageal squamous cell carcinoma. CancerCell.2023Nov13;41(11):1852-1870.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2023.09.011. Epub 2023 Oct 12. PMID: 37832554.