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为什么要检测样本中的微生物总量?
目前细菌群落研究常用的技术是16S扩增子测序。常规16S扩增子测序方法能解析样本中的物种组成和其相对丰度信息,因此对微生态研究具有重要的促进作用。然而我们需要注意一点,那就是相对丰度并不能反映样本中每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异,这是因为相对丰度分析忽略了不同样本之间总体微生物量存在的现实差异,造成了分析结果的偏差,而绝对定量分析则是计量样本中每种微生物的16S基因拷贝数或者数目,从而实现绝对定量,因此相对于常规16S相对定量扩增子测序,绝对定量分析能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异。微生物的绝对定量是进行微生态研究的重要研究方法,是非常有必要的。
实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是定量物种绝对丰度的金标准,但是针对存在于样品中的每种细菌开发一套qPCR检测方法显然是不切实际的,因此可以联合常规16S相对定量扩增子测序(获取每个物种的相对丰度)和总细菌qPCR(获取总细菌载量)来获得每个物种的绝对丰度。总体而言,基于这两种技术联合推断的特定物种的绝对丰度虽然对相对丰度较低的物种来说可能存在一定的误差,但在某种程度上提供了一个机会来评估细菌物种的绝对丰度,尤其适合于高丰度物种的绝对丰度推断。
什么是qPCR?
qPCR是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量(与内参基因对比)或绝对定量(通过标准曲线对未知模板进行定量)实现对各个样本的DNA或RNA进行定量的方法。本篇推文主要介绍采用绝对定量的方法对样本中微生物总量进行检测的方法。
qPCR荧光试剂的工作原理及区别
qPCR中常用的荧光试剂有2类,分别是SYBR GreenⅠ荧光染料和TaqMan探针。
SYBR Green I染料可与PCR过程中产生的所有双链DNA结合,从而对PCR的产物进行定量检测。
TaqMan探针是一种基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针,可在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行定量检测。
TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂会检测所有双链DNA,包括非特异性的PCR反应产物。下面的表格中列出了基于两种荧光染料的qPCR检测方法的优缺点。
微生物总量的绝对定量方法
绝对定量是测定目的基因在样本中的分子数目,通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量,即通常所说的拷贝数。
在整个qPCR过程中,首先需要构建标准质粒,然后将质粒DNA倍比稀释后作为模板进行qPCR,以标准质粒模板起始拷贝数为横坐标,荧光信号达设定阈值是所经历的循环数Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,拟合线性方程。随后以待测样本中的细菌DNA为模板进行qPCR,通过与标准曲线的比较来计算出待测样本中的细菌拷贝数。
图1 扩增曲线
图2 标准曲线
每微升标准质粒拷贝数(copies/μl)=[质粒浓度(ng/ul)×10-9×6.02×1023]/PCR产物相对分子质量;
原始待测样本总细菌拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数;
原始待测样本总细菌拷贝数copies/g样本=(原始待测样本总细菌拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA总体积)/样本抽提重量。
总菌绝对定量的应用场景
1)伪无菌鼠构建成功的评估
肠道菌群的临床研究已经逐步从相关关系进一步进展到因果关系的研究。这里就需要通过粪菌移植将肠道菌群移植到无菌动物中来验证其功能。无菌鼠是一种常用的无菌动物。然而,无菌鼠价格高昂且供不应求,伪无菌鼠就成为了一种性价比很高的无菌鼠“平替”了。伪无菌鼠是通过抗生素清除SPF级小鼠的肠道菌群,使其肠道接近无菌状态。
那怎么评估伪无菌鼠是否构建成功了呢?通过qPCR的方法测定抗生素处理前后小鼠粪便中的细菌总量,如果抗生素处理后小鼠粪便中的细菌总量低于处理前的10%,即抗生素处理后细菌的去除率达到90%以上,就可认为伪无菌鼠已经构建成功,可用于后续研究中。
2)益生元/合生元等活菌产品中益生菌总量的检测
市场上有非常多益生元/合生元产品,宣称其每克产品中含有几百亿益生菌。那么怎么检测产品中是否真的含有那么多数量的益生菌呢?这个时候采用qPCR对产品中的益生菌进行绝对定量的检测,就能获得每克产品中益生菌的总量了。
3)活性成分/药物抑菌/促菌效果的评估
在一些药物或者活性或者药物的研发过程中,经常需要对其抑菌或促菌效果进行评估。比如说一款有治疗或改善痤疮的药物,需要评估其对痤疮相关细菌的抑制或杀灭作用如何,这时候采用qPCR对药物处理前后相应细菌的数量进行绝对定量,就能对其抑菌效果进行很好地评估了。
4)功能菌培养条件的摸索
基础研究中分离到某个菌具有重要的功能,比方说可以降解某些有害物质,或者缓解某个疾病状态等,在研究中需要对这个菌进行大规模扩大培养,这时候也可以通过qPCR检测不同培养条件下细菌的绝对数量,以确定细菌的最佳培养条件。
样本采集基本原则/注意事项: 在抗菌药物使用前采集标本(验证除菌效果的除外); 注意采样器具的无菌和严格无菌操作; 样本信息的一致性和完整性
【样本要求】
在Antibacterial药物使用前采集标本(验证除菌效果的除外);
注意采样器具的无菌和严格无菌操作;
样本信息的一致性和完整性。
样本类型 |
样本要求 |
储存和运输要求 |
粪便/肠道内容物 |
人粪便≥200mg/例;大鼠粪便1-2颗;小鼠粪便≥2颗;人不成形稀便≥1mL/例。 注意: 采集容器洁净无菌,不得混有尿液,不可有消毒剂、污水等其他污染物。 若使用常温保护剂,需按照保护剂使用说明书中推荐的样本采集量且充分混匀。 |
选择合适的容器容纳样本,注意密封性,如有必要可用封口膜密封;容器上的样本编号应清晰且标签不易脱落。 新鲜采集的样本应立即-80℃/液氮保存,或暂至于干冰上转移至-80℃/液氮保存;保存期间切忌反复冻融。 运输时勿将最小单位的容器直接散落在干冰中;使用泡沫盒+干冰+冰袋的组合。 若无法满足低温储藏及运输的条件,可使用慕柏生物研发的保护剂(适用于粪便样本)进行常温储存和运输。 |
拭子 |
≥2支/例,采集时应保证采样部位无污染,例如采集舌苔拭子时不要触碰到牙齿。 注意: 拭子可用无菌生理盐水/无菌水/PBS缓冲液润湿,增加微生物附着率; 拭子头部充分裹匀样本; 样本采集完成后将拭子头折断置于离心管/冻存管中。 |
|
组织 |
≥1g/例(活检组织除外),使用预冷的无菌生理盐水/无菌水/PBS缓冲液将组织样本的血渍污染物冲洗至少2次,置于1.5或2mL离心管中。 活检组织置于无菌滤纸上,送入1.5或2mL离心管中。 |
|
发酵液 |
≥1mL/例,离心沉淀菌体时应有明显沉淀物。 |
|
唾液/痰液 |
≥1mL/例,建议晨起取样且取样前不要喝水、吸烟、饮酒、刷牙等。 |
|
土壤/沉积物 |
≥1g/例,需去除表层浮土、杂草、虫子、细根等杂物。 |
|
DNA溶液 |
≥50 ng/μL,体积≥50μL; 有明显主带,无降解,无RNA、蛋白质污染; 若为特殊样本抽提的DNA浓度较低,需提前与技术支持沟通。 |
建议用封口膜密封离心管。 避免DNA反复冻融。-20℃/-40℃/-80℃皆可长期保存。 建议干冰运输,若为闪送或当日达,可冰袋运输。 |
其他 |
需提前与技术支持沟通 |
参考文献
Zhao, J. et al. Expansion of Escherichia-Shigella in Gut Is Associated with the Onset and Response to Immunosuppressive Therapy of IgA Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology, ASN.2022020189, doi:10.1681/ASN.2022020189 (2022).
为什么要检测样本中的微生物总量?
目前细菌群落研究常用的技术是16S扩增子测序。常规16S扩增子测序方法能解析样本中的物种组成和其相对丰度信息,因此对微生态研究具有重要的促进作用。然而我们需要注意一点,那就是相对丰度并不能反映样本中每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异,这是因为相对丰度分析忽略了不同样本之间总体微生物量存在的现实差异,造成了分析结果的偏差,而绝对定量分析则是计量样本中每种微生物的16S基因拷贝数或者数目,从而实现绝对定量,因此相对于常规16S相对定量扩增子测序,绝对定量分析能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异。微生物的绝对定量是进行微生态研究的重要研究方法,是非常有必要的。
实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是定量物种绝对丰度的金标准,但是针对存在于样品中的每种细菌开发一套qPCR检测方法显然是不切实际的,因此可以联合常规16S相对定量扩增子测序(获取每个物种的相对丰度)和总细菌qPCR(获取总细菌载量)来获得每个物种的绝对丰度。总体而言,基于这两种技术联合推断的特定物种的绝对丰度虽然对相对丰度较低的物种来说可能存在一定的误差,但在某种程度上提供了一个机会来评估细菌物种的绝对丰度,尤其适合于高丰度物种的绝对丰度推断。
什么是qPCR?
qPCR是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量(与内参基因对比)或绝对定量(通过标准曲线对未知模板进行定量)实现对各个样本的DNA或RNA进行定量的方法。本篇推文主要介绍采用绝对定量的方法对样本中微生物总量进行检测的方法。
qPCR荧光试剂的工作原理及区别
qPCR中常用的荧光试剂有2类,分别是SYBR GreenⅠ荧光染料和TaqMan探针。
SYBR Green I染料可与PCR过程中产生的所有双链DNA结合,从而对PCR的产物进行定量检测。
TaqMan探针是一种基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针,可在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行定量检测。
TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂会检测所有双链DNA,包括非特异性的PCR反应产物。下面的表格中列出了基于两种荧光染料的qPCR检测方法的优缺点。
微生物总量的绝对定量方法
绝对定量是测定目的基因在样本中的分子数目,通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量,即通常所说的拷贝数。
在整个qPCR过程中,首先需要构建标准质粒,然后将质粒DNA倍比稀释后作为模板进行qPCR,以标准质粒模板起始拷贝数为横坐标,荧光信号达设定阈值是所经历的循环数Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,拟合线性方程。随后以待测样本中的细菌DNA为模板进行qPCR,通过与标准曲线的比较来计算出待测样本中的细菌拷贝数。
图1 扩增曲线
图2 标准曲线
每微升标准质粒拷贝数(copies/μl)=[质粒浓度(ng/ul)×10-9×6.02×1023]/PCR产物相对分子质量;
原始待测样本总细菌拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数;
原始待测样本总细菌拷贝数copies/g样本=(原始待测样本总细菌拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA总体积)/样本抽提重量。
总菌绝对定量的应用场景
1)伪无菌鼠构建成功的评估
肠道菌群的临床研究已经逐步从相关关系进一步进展到因果关系的研究。这里就需要通过粪菌移植将肠道菌群移植到无菌动物中来验证其功能。无菌鼠是一种常用的无菌动物。然而,无菌鼠价格高昂且供不应求,伪无菌鼠就成为了一种性价比很高的无菌鼠“平替”了。伪无菌鼠是通过抗生素清除SPF级小鼠的肠道菌群,使其肠道接近无菌状态。
那怎么评估伪无菌鼠是否构建成功了呢?通过qPCR的方法测定抗生素处理前后小鼠粪便中的细菌总量,如果抗生素处理后小鼠粪便中的细菌总量低于处理前的10%,即抗生素处理后细菌的去除率达到90%以上,就可认为伪无菌鼠已经构建成功,可用于后续研究中。
2)益生元/合生元等活菌产品中益生菌总量的检测
市场上有非常多益生元/合生元产品,宣称其每克产品中含有几百亿益生菌。那么怎么检测产品中是否真的含有那么多数量的益生菌呢?这个时候采用qPCR对产品中的益生菌进行绝对定量的检测,就能获得每克产品中益生菌的总量了。
3)活性成分/药物抑菌/促菌效果的评估
在一些药物或者活性或者药物的研发过程中,经常需要对其抑菌或促菌效果进行评估。比如说一款有治疗或改善痤疮的药物,需要评估其对痤疮相关细菌的抑制或杀灭作用如何,这时候采用qPCR对药物处理前后相应细菌的数量进行绝对定量,就能对其抑菌效果进行很好地评估了。
4)功能菌培养条件的摸索
基础研究中分离到某个菌具有重要的功能,比方说可以降解某些有害物质,或者缓解某个疾病状态等,在研究中需要对这个菌进行大规模扩大培养,这时候也可以通过qPCR检测不同培养条件下细菌的绝对数量,以确定细菌的最佳培养条件。
样本采集基本原则/注意事项: 在抗菌药物使用前采集标本(验证除菌效果的除外); 注意采样器具的无菌和严格无菌操作; 样本信息的一致性和完整性
【样本要求】
在Antibacterial药物使用前采集标本(验证除菌效果的除外);
注意采样器具的无菌和严格无菌操作;
样本信息的一致性和完整性。
样本类型 |
样本要求 |
储存和运输要求 |
粪便/肠道内容物 |
人粪便≥200mg/例;大鼠粪便1-2颗;小鼠粪便≥2颗;人不成形稀便≥1mL/例。 注意: 采集容器洁净无菌,不得混有尿液,不可有消毒剂、污水等其他污染物。 若使用常温保护剂,需按照保护剂使用说明书中推荐的样本采集量且充分混匀。 |
选择合适的容器容纳样本,注意密封性,如有必要可用封口膜密封;容器上的样本编号应清晰且标签不易脱落。 新鲜采集的样本应立即-80℃/液氮保存,或暂至于干冰上转移至-80℃/液氮保存;保存期间切忌反复冻融。 运输时勿将最小单位的容器直接散落在干冰中;使用泡沫盒+干冰+冰袋的组合。 若无法满足低温储藏及运输的条件,可使用慕柏生物研发的保护剂(适用于粪便样本)进行常温储存和运输。 |
拭子 |
≥2支/例,采集时应保证采样部位无污染,例如采集舌苔拭子时不要触碰到牙齿。 注意: 拭子可用无菌生理盐水/无菌水/PBS缓冲液润湿,增加微生物附着率; 拭子头部充分裹匀样本; 样本采集完成后将拭子头折断置于离心管/冻存管中。 |
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组织 |
≥1g/例(活检组织除外),使用预冷的无菌生理盐水/无菌水/PBS缓冲液将组织样本的血渍污染物冲洗至少2次,置于1.5或2mL离心管中。 活检组织置于无菌滤纸上,送入1.5或2mL离心管中。 |
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发酵液 |
≥1mL/例,离心沉淀菌体时应有明显沉淀物。 |
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唾液/痰液 |
≥1mL/例,建议晨起取样且取样前不要喝水、吸烟、饮酒、刷牙等。 |
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土壤/沉积物 |
≥1g/例,需去除表层浮土、杂草、虫子、细根等杂物。 |
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DNA溶液 |
≥50 ng/μL,体积≥50μL; 有明显主带,无降解,无RNA、蛋白质污染; 若为特殊样本抽提的DNA浓度较低,需提前与技术支持沟通。 |
建议用封口膜密封离心管。 避免DNA反复冻融。-20℃/-40℃/-80℃皆可长期保存。 建议干冰运输,若为闪送或当日达,可冰袋运输。 |
其他 |
需提前与技术支持沟通 |
参考文献
Zhao, J. et al. Expansion of Escherichia-Shigella in Gut Is Associated with the Onset and Response to Immunosuppressive Therapy of IgA Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology, ASN.2022020189, doi:10.1681/ASN.2022020189 (2022).