【技术原理】

  DNA甲基化(DNA methylation)是一种关键的表观遗传学机制，通过DNA甲基转移酶在二核苷酸的胞嘧啶C-5位添加一个甲基基团，引起不同基因的转录刺激或抑制，并调节各种细胞功能。这种DNA化学修饰可以在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。细胞 DNA 甲基化状态的变化与衰老，发育和疾病病理有关。

  Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip Kit(935K)是一种全基因组甲基化筛选工具，靶向人类甲基化组具生物学意义的区域中超过 935,000 个 CpG 位点，同时在其前代产品MethylationEPIC v1.0(850k)的基础上极大的提高了向后兼容性。该芯片保留了以单核苷酸分辨率定量分析全基因组 CpG 的能力，同时提供高度准确和精确的甲基化测量，不受测序深度的影响。可使用精简、用户友好的 Infinium 甲基化检测分析多种 DNA 样本类型，包括从 FFPE 分离的 DNA 样本。与其他方法相比，MethylationEPIC v2.0 具有可扩展性和更低的单个样本总成本，因此可用于探究疾病机制和生物标志物的筛选。

【技术优势】

  MethylationEPIC BeadChip兼具全方面的覆盖范围和高通量功能，因此是全表观基因组关联研究(EWAS)的理想之选。

  全方面的基因组覆盖范围：检测> 935,000 个 CpG 位点，全方面覆盖 CpG 岛、启动子、编码区及增强子。

  探针位点的全方面优化：在 EPICv1.0-850K 的基础上去除了性能不佳的探针，新增186,000 个 CpG 靶向增强子和超级增强子、更多 CTCF 结合位点、CNV 检测区域、EPIC v1.0 覆盖不足的 CpG 岛以及常见cancer驱动突变。

  兼容多种样本类型，包括 FFPE：935K 芯片检测兼容 FFPE、新鲜/冷冻组织、全血、口腔细胞、cfDNA、唾液和其他样本类型。FFPE 兼容性对于cancer研究极为重要，能够支持以大型tumor生物样本库为基础的研究。

  分辨率高：单碱基分辨率，可以直接检测到发生甲基化的准确位点。

  高度准确和精确的检测数据：935K 甲基化芯片检测能够检测到 0.2 的 beta 值差异，假阳性率低于 1%，从而实现了较高的分析灵敏度，同时也具有极好的数据可重现性。

【研究方向】

  935K 芯片靶向人类基因甲基化组，主要面向医学领域，可以涉及以下几个研究方向：

  tumor：肺cancer、食管cancer、胶质瘤、白血病等疾病研究和tumor标志物;

  复杂疾病：自身免疫性疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、衰老等的研究;

  发育：胚胎发育、神经分化、organ分化等研究;

  环境互作：环境污染、吸烟、孕期暴露等研究。

【案例介绍】

  标题：通过整合DNA甲基化和RNA-Seq数据分析鉴定类风湿性关节炎中DNA甲基化调节的差异表达基因

  期刊：Journal of Translational Medicine

  影响因子：7.4

  研究对象：类风湿性关节炎

1、 研究背景

  类风湿性关节炎 (RA) 是一种以滑膜炎和系统炎症为特征的自身免疫性疾病，可影响包括滑膜组织在内的许多组织，导致关节肿胀和疼痛。其发病机制尚不十分清楚，包括免疫相关基因的异常表达、免疫相关通路的activation等。因此，鉴定参与 RA 致病过程的基因和信号通路非常重要。

2、 研究方法

  通过 RNA-Seq 和 Illumina 850K DNA 甲基化 BeadChip 生成 9 个 RA 和 15 个 OA 滑膜组织的转录和 DNA 甲基化谱。使用基因集富集分析(GSEA)和加权基因共表达网络分析(WGCNA)来分析甲基化调控的表达基因。通过比较差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)，鉴定甲基化调节的差异表达基因(MeDEGs)，分析MeDEGs的功能相关性，基于MeDEGs构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并挑选枢纽基因，对关键基因的甲基化水平和mRNA表达量进行相关性分析。

3、 研究结果

  在本研究中，在转录组测序数据中鉴定出 17,736 个基因，在 Illumina 850K BeadChip 数据中鉴定出25,578 个甲基化基因，两组数据交叉后，总共获得了16,421个甲基化调控的表达基因。

  GSEA 显示这些基因与免疫反应、适应性免疫反应、炎症反应的activation相关。KEGG分析发现这些基因与类风湿性关节炎、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路相关。 WGCNA显示turquoise模块与RA表现出most强的相关性。

  图2 RA中差异表达基因和差异甲基化探针

  基于转录组和甲基化组的差异分析筛选了 851 个 DEGs 和 16,250 个 DMGs，两者交叉后总共获得了 707 个 MeDEGs。GO分析显示，MeDEGs富集于信号转导、细胞粘附、G蛋白偶联受体信号通路、质膜和膜的组成成分、相同蛋白结合、钙离子结合等功能。KEGG通路分析显示MeDEGs富集于钙信号通路、T细胞受体信号通路、NF-κB信号通路、类风湿性关节炎等。

  图3 MeDEGs的GO和KEGG通路分析

  PPI分析筛选出8个与RA相关的功能模块。根据PPI分析和WGCNA分析的结果，确定SPP1、RGS1、RAC2、MMP3、IL32、CD52、CCL5是其中的枢纽基因。Spearman相关分析进一步显示RGS1(cg10718027)、RGS1(cg02586212)、RGS1(cg10861751)与RA明显相关。

  图4 差异甲基化位置/基因的甲基化程度与mRNA的相关性分析

4、 研究结论

  本研究通过对转录组和DNA甲基化组的综合生物信息学分析揭示了与 RA 相关的基因的分子功能。研究结果表明G 蛋白信号传导调节因子 1 (RGS1)可作为 RA 的新型甲基化生物标志物，是RA诊断和treatment的潜在靶点。

【实验流程】

【数据分析】

【送样要求】

1. 细胞样本(只限于人体细胞)：

2. 组织样本(只限于人体组织)

3. 血液样本(只限于人体血液)

4. 其他样本类型

参考文献

Zhang, R. et al. Identification of DNA methylation-regulated differentially expressed genes in RA by integrated analysis of DNA methylation and RNA-Seq data. Journal of Translational Medicine 20, doi:10.1186/s12967-022-03664-5 (2022).